一、粪大肠菌群情况简要介绍

  粪大肠菌群，又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms），44.5℃ 培养 24h，能在 MFC 选择性培养基上生长，发酵乳糖产酸，并形成蓝色或蓝绿色菌落的肠杆菌科细菌。

  该菌群来自人和温血动物粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

 

二、参考标准

  海博官网-标准下载：HJ347.1-2018 水质粪大肠菌群的测定滤膜法

 

三、检验原理

  样品通过孔径为 0.45μm 的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于 MFC 选择性培养基上，在特定的温度（44.5℃）下培养 24h，胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。

 

四、检验方法以及结果分析

  4.1 样品

  4.1.1 样品采集

  点位布设及采样频次按照 GB/T14581、HJ/T494 和 HJ/T91 的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。样品采集量可根据水体实际情况而定，一般不少于 250mL。

  采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面 10cm～15cm 处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80% 左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。

  从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 3min～5min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌或用70%～75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。

  采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。

  如果采集的是含有活性氯样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液，以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125mL 容积加入 0.1mL 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入 C10H14N2Na2O8 溶液，以消除干扰（每 125mL 容积加入 0.3mL 的 C10H14N2Na2O8 溶液）。

  注：15.7mg 硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。

  4.1.2  样品保存

  采样后应在 2h 内检测，否则，应 10℃ 以下冷藏但不得超过 6h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品在 4℃ 以下冷藏并在 2 h 内检测。

  4.2 分析步骤 

  4.2.1 样品过滤

  根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为 10mL，如接种量小于 10mL时应逐级稀释。

先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的 1/10 和10 倍，分别过滤。理想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为 20 个～60 个，总菌落数不得超过 200 个。当最小过滤体积为 10mL，滤膜上菌落密度仍过大时，则应对样品进行稀释。1:10 稀释的方法为：吸取 10mL 样品，注入盛有90mL无菌水的三角烧瓶中，混匀，制成 1:10 稀释样品。样品接种量参考表见表 1。

表1 接种量参考表

  用灭菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水冲洗器壁 2 次～3 次。样品过滤完成后，再抽气约 5s，关上开关。

  4.2.2 培养

  用灭菌镊子夹取滤膜移放在 MFC 培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将培养皿倒置，放入恒温培养箱内，44.5℃±0.5℃ 培养 24h±2h。

  MFC 培养基检验原理：胰胨、多胨和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；乳糖为可发酵糖类；三号胆盐抑制革兰氏阳性菌；琼脂是培养基的凝固剂；玫红酸和苯胺蓝为 pH 指示剂。粪大肠菌群可在 44.5℃ 条件下分解乳糖产酸，使培养基pH下降，菌落为亮蓝色，其他不发酵乳糖的肠道菌菌落为无色、灰色或淡红色。

  用法：称取本品  52.3 克，加热煮沸溶解于 1000mL 蒸馏水中，冷却至 45℃-50℃ 时，倾入无菌平皿。无需高压灭菌。

图1 不同细菌在 MFC 琼脂上的生长特征

  4.2.3 对照试验

  （1）空白对照

  每次试验都要用无菌水按照步骤 4.2.1 和 4.2.2 进行实验室空白测定。

  （2）阳性及阴性对照

  将粪大肠菌群的阳性菌株（如大肠埃希氏菌Escherichia coli）和阴性菌株（如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes）制成浓度为 40～600CFU/L 的菌悬液，分别按照 4.2.1～4.2.2 步骤培养，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

 

五、结果计算与表示

  5.1 结果判读

  MFC 培养基上呈蓝色或蓝绿色的菌落为粪大肠菌群菌落，予以计数。MFC 培养基上呈灰色、淡黄色或无色的菌落为非粪大肠菌群菌落，不予计数。

  5.2 结果计算

  样品中的粪大肠菌群数（CFU/L），按照下列公式进行计算：

  式中：C——样品中粪大肠菌群数，CFU/L；

  C₁——滤膜上生长的粪大肠菌群菌落总数，个；

  1000——将过滤体积的单位由mL转换为L；

  f——样品接种量，mL；

  注：若平行样结果都在 20～60CFU/L 范围内，最终结果取平均值以几何平均计算。

  5.3 结果表示

  测定结果保留至整数位，最多保留两位有效数字，当测定结果 ≥100 CFU/L 时，以科学计数法表示。

 

六、注意事项：

  6.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集时加硫代硫酸钠溶液消除干扰。

  6.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集时加入 C10H14N2Na2O8 溶液消除干扰。

 

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